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Nature volume 615, páginas 925–933 (2023)Cite este artigo

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A duplicação do genoma completo (WGD) é um evento recorrente em cânceres humanos e promove instabilidade cromossômica e aquisição de aneuploidias1,2,3,4,5,6,7,8. No entanto, a organização tridimensional da cromatina nas células WGD e a sua contribuição para os fenótipos oncogénicos são atualmente desconhecidas. Aqui mostramos que em células deficientes em p53, o WGD induz perda de segregação da cromatina (LCS). Este evento é caracterizado pela segregação reduzida entre cromossomos curtos e longos, subcompartimentos A e B e domínios de cromatina adjacentes. O LCS é impulsionado pela regulação negativa de CTCF e H3K9me3 em células que contornaram a ativação do ponto de verificação tetraplóide. Análises longitudinais revelaram que o LCS prepara regiões genômicas para o reposicionamento de subcompartimentos em células WGD. Isto resulta em alterações epigenéticas e na cromatina associadas à ativação do oncogene em tumores resultantes de células WGD. Notavelmente, os eventos de reposicionamento de subcompartimentos foram em grande parte independentes de alterações cromossômicas, o que indica que estes eram mecanismos complementares que contribuíam para o desenvolvimento e progressão do tumor. No geral, o LCS inicia alterações na conformação da cromatina que resultam em modificações epigenéticas e transcricionais oncogênicas, o que sugere que a evolução da cromatina é uma marca registrada do câncer causado pelo WGD.

WGD é definido pela duplicação de todo o conjunto de cromossomos dentro de uma célula. Foi observado em lesões precoces e pré-malignas de vários tecidos2,9,10 e estima-se que ocorra em aproximadamente 30% dos cânceres humanos3. O WGD favorece a aquisição de alterações cromossômicas5,6,7,8 em origens genéticas permissivas, como em células deficientes em p53 ou Rb3,4, que podem promover a tumorigênese1,5. No entanto, é igualmente provável que a tetraploidização em núcleos únicos induza alterações na estrutura tridimensional (3D) e nas características epigenéticas da cromatina. Durante a interfase, a cromatina é organizada em uma arquitetura 3D multicamadas de compartimentos, domínios de cromatina e alças11,12,13,14,15,16, e está intimamente associada à atividade da cromatina e aos estados celulares17. Alterações na estrutura da cromatina foram relatadas em muitos tipos de tumores e são devidas a alterações na ligação de CTCF ou coesina , variantes estruturais cromossômicas 20,21,22 ou modificações aberrantes de histonas . Aqui investigamos como a cromatina é organizada nas células que sofrem WGD. Além disso, estudamos quais características da estrutura da cromatina são afetadas pelo WGD e se alterações na organização da cromatina emergem e afetam os fenótipos celulares após o WGD. Finalmente, examinamos se essas alterações se correlacionam com alterações genéticas e epigenéticas em tumores causados por WGD.

Para compreender o impacto do WGD na organização da cromatina e no desenvolvimento do tumor, utilizamos três modelos celulares distintos: (1) a linhagem celular diplóide não transformada hTERT-RPE1 (doravante denominada RPE); (2) células CP-A derivadas de um paciente com esôfago de Barrett, uma condição pré-cancerosa que predispõe ao desenvolvimento de adenocarcinoma esofágico através de WGD9,26; e (3) a linhagem celular K562 quase triplóide leucêmica. Para imitar o fundo genético permissivo observado em tumores humanos , usamos células CP-A deficientes em p53 (Extended Data Fig. 1a) e RPE (anteriormente denominadas células RPETP53 -/-) . As células K562 já abrigam uma mutação de perda de função no gene TP53. As células WGD foram obtidas através de deslizamento mitótico em dois clones independentes CP-A TP53 -/- (clone 3 e clone 19) e células K562, e através de falha de citocinese usando dois protocolos distintos em células RPE TP53 -/- (Fig. 1a). Para controlar as alterações na conformação da cromatina associadas à instabilidade cromossômica (NIC), mas não ao WGD, induzimos NIC em células RPE TP53 -/- usando um inibidor de MPS1 (Fig. 1a). As análises do ciclo celular e do cariótipo confirmaram que o número de cromossomos dobrou após o tratamento na maioria das células (Fig. 1b, c e Dados Estendidos Fig. 1b-g) e que o tamanho nuclear aumentou (Dados Estendidos Fig. 1h).

1, adjusted P < 0.01) were enriched in the interferon signalling pathway (Extended Data Fig. 4b), which is consistent with responses to abnormal mitotic segregation and stress31. Conversely, significantly downregulated genes (n = 619, log2(FC) < −1, adjusted P < 0.01) were enriched in the DNA replication, DNA repair and cell cycle pathways (Extended Data Fig. 4c), which is consistent with downregulation of DNA replication proteins in WGD cells7. Changes in expression were not associated with changes in compartment segregation and only moderately with boundary loss of insulation (Extended Data Fig. 4d,e), which indicated that these changes mostly reflected an acute cell response to WGD. In summary, WGD cells, but not CIN-only cells, exhibit LCS manifested in an increased proportion of contacts between long and short chromosomes, distinct chromatin subcompartments, and TADs./p> 0.4), which is a known oncogenic variant37. Nevertheless, this mutation was already present in RPE TP53−/− cells before WGD, and it was not sufficient to induce tumorigenesis in mice (Fig. 4c). Conversely, mutations that were acquired post-WGD did not include known oncogenic variants (Supplementary Table 3)./p> 0.3). These changes comprised upregulation of inducers of cell proliferation and migration such as CDC42, NRAS and JUN (chromosome 1p)42,43, and downregulation of CENPF (chromosome 1q), which is associated with mitotic errors44. NRAS copy number gain was accompanied by an increase in Q61R variant allele frequency (VAFtumour1 = 0.9, VAFtumour2 = 0.75, VAFtumour3 = 0.74), which suggested that the mutated allele was in the amplified haplotype. JUN overexpression was concomitant with an upregulation of components of the AP-1 transcription factor complex (JUND, JUNB, FOS and FOSB) and its downstream targets (Extended Data Fig. 8h). In summary, tumours originated from RPE TP53−/− cells that underwent WGD exhibited hallmarks of WGD-driven human tumours, such as increased CIN and complex rearrangements potentially associated with oncogene activation./p>

4N peak) were bulk sorted. Cells were allowed to recover overnight and then fixed for downstream analyses./p>

90%). Only Hi-C interactions for which anchors mapped strictly to one of the two haplotypes were retained for analysis, thus obtaining three sets of interaction types: Hap1–Hap1, Hap1–Hap2 and Hap2–Hap2./p>

2 for diploid loci) would indicate a nuclei aggregate rather than a single nucleus. Following dispensing, the single nuclei were de-crosslinked by incubation at 65 °C overnight. Next each selected nucleus was mixed with 25 µl Dynabeads MyOne Streptavidin C1 and transferred to a 1.5 ml tube and incubated at room temperature for 1 h on a rotating wheel. The bead-bound fragments were digested with 10 U of AluI restriction enzyme (New England Biolabs, R0137) in 1× rCutSmart buffer (New England Biolabs, B6004) at 37 °C for 2 h. A-tailing reaction and adapter ligation were performed for each single cell as for the bulk Hi-C processing. Similarly, PCR amplification of the single cell libraries was performed in the same master mix as described above for bulk Hi-C, for 27–30 cycles. Libraries were cleaned using AMPure XP beads and then ran on a 2% agarose gel at 100 V for 50–60 min. Successful libraries presented a 300–700 bp smear, which was cut from the gel. DNA purification from the agarose was performed using NucleoSpin Gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel, 740609) following the manufacturer’s instructions. An additional AMPure XP bead size selection was generally necessary to remove any primer dimer contamination. Libraries were sequenced on a NextSeq550 platform (Illumina) in a PE75 configuration./p>

= 6, it was kept./p>

4N) (b) and c, Quantification of chromosomes per cell via karyotyping. Data are mean ± s.d.; Number of independent experiments is indicated. Violin plots: dashed line is median d, Examples of chromosomal instability markers (telomere fusion and chromosome breakages) in CP-ATP53−/− clone 19 cells 24 h post-WGD. n = 3 out of 30 total karyotypes presented such markers. Red arrows indicate affected chromosomes. e, Examples of bipolar and multipolar division in RPETP53−/− cells (Control and 24 h post-WGD). n = 5 dividing cells were detected for each phenotype out of ~100 total cells. Nuclei are stained in blue (DAPI), cytoskeleton (alpha-tubulin) in red, and centrosomes (pericentrin) in green./p>