Limites de domínio de associação topológica são necessários para a função normal do genoma

Biologia das Comunicações, volume 6, número do artigo: 435 (2023) Citar este artigo

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Os limites do domínio de associação topológica (TAD) dividem o genoma em territórios regulatórios distintos. Evidências anedóticas sugerem que a sua interrupção pode interferir na expressão gênica normal e causar fenótipos de doenças1,2,3, mas a extensão geral em que isso ocorre permanece desconhecida. Aqui demonstramos que as deleções direcionadas dos limites do TAD causam uma série de interrupções na função normal do genoma in vivo e no desenvolvimento do organismo. Usamos a edição do genoma CRISPR em camundongos para excluir individualmente oito limites TAD (tamanho de 11 a 80 kb) do genoma. Todas as deleções examinadas resultaram em fenótipos moleculares ou de organismo detectáveis, que incluíam interações alteradas da cromatina ou expressão gênica, viabilidade reduzida e fenótipos anatômicos. Observamos mudanças na arquitetura local da cromatina 3D em 7 de 8 (88%) casos, incluindo a fusão de TADs e frequências de contato alteradas dentro de TADs adjacentes ao limite excluído. Para 5 dos 8 (63%) loci examinados, as deleções de limites foram associadas ao aumento da letalidade embrionária ou a outros fenótipos de desenvolvimento. Por exemplo, uma deleção do limite TAD perto de Smad3/Smad6 causou letalidade embrionária completa, enquanto uma deleção perto de Tbx5/Lhx5 resultou em uma malformação pulmonar grave. Nossas descobertas demonstram a importância das sequências limite do TAD para a função do genoma in vivo e reforçam a necessidade crítica de considerar cuidadosamente a potencial patogenicidade das deleções não codificantes que afetam os limites do TAD na triagem genética clínica.

Os genomas eucarióticos dobram-se em domínios de associação topológica (TADs), segmentos de cromatina em escala sub-megabase caracterizados por alta frequência de contato intra-domínio da cromatina . Os TADs representam uma característica fundamental da organização hierárquica do genoma, definindo vizinhanças de cromatina dentro das quais as sequências reguladoras podem interagir, ao mesmo tempo que isolam as interações regulatórias através das fronteiras5,7,8,9,10. Os limites do TAD são definidos e medidos principalmente por meio de ensaios de conformação da cromatina e são normalmente associados a um conjunto de assinaturas de proteínas, incluindo o fator de ligação ao CCCTC (CTCF), componentes do complexo de manutenção estrutural dos cromossomos (SMC), como coesina e condensina, e RNA polimerase II5,11,12,13,14. Os TADs se formam como resultado da extrusão da alça, em que as fitas de DNA deslizam de dentro da coesina ou do complexo SMC até que as moléculas de CTCF ligadas em uma orientação convergente sejam encontradas13,15,16,17,18,19. A perda de CTCF, coesina ou do fator de carga de coesina Nipbl resulta na ruptura do TAD, enquanto a perda do fator de liberação de coesina, Wapl, resulta no reforço dos limites do TAD . Curiosamente, cerca de 20% dos limites do TAD permanecem estáveis após a perda do CTCF22. Tanto os mecanismos mediados por CTCF quanto a transcrição podem afetar a formação e a função dos TADs, mas nenhum parece ser individualmente suficiente nem universalmente necessário7,11,23,24. Assim, o estado da cromatina, a atividade transcricional e a organização do TAD podem influenciar-se mutuamente, e a estrutura nuclear observada dos genomas dos mamíferos provavelmente resulta da sua interação complexa7,11,23,24,25.

As localizações genómicas dos limites do TAD estão bem conservadas entre as espécies de mamíferos, indicando que a sua função e posições dentro do genoma estão sujeitas a restrições evolutivas5,26,27,28. Esta noção é ainda apoiada pelo esgotamento geral de variantes estruturais nos limites do TAD observado na população humana em geral26, enquanto perturbações e rearranjos da estrutura do TAD têm sido implicados na expressão incorreta de genes e estão associados a fenótipos de desenvolvimento e de câncer1,2, 3,29,30. No entanto, a maioria destas perturbações ocorreram espontaneamente em grandes mutações estruturais que também incluíam características genómicas vizinhas, tais como elementos reguladores e/ou genes codificadores de proteínas. Portanto, o papel específico dos limites do TAD nestes fenótipos não é bem compreendido. No presente estudo, examinamos a necessidade funcional das sequências limite do TAD in vivo. Selecionamos oito limites independentes de TAD nas proximidades de genes ativos durante o desenvolvimento embrionário, excluímos individualmente esses limites do genoma do camundongo e examinamos sistematicamente as consequências na sobrevivência, organização do genoma, expressão gênica e desenvolvimento. Todas as oito exclusões de limites TAD causaram alterações em uma ou mais dessas propriedades. Observamos também que a perda de limites com mais locais de CTCF geralmente resultou em fenótipos mais graves e que os fenótipos mais graves do organismo coincidiram com alterações pronunciadas na conformação da cromatina. Em combinação, nossos resultados indicam que as sequências limites do TAD são necessárias para o funcionamento e desenvolvimento normal do genoma.

3300 previously annotated TAD boundaries5,10, we scored and prioritized each boundary based on the following criteria: (1) CTCF occupancy aggregated from 62 published CTCF ChIP-seq datasets, which served as a proxy for the expected overall strength of insulation (datasets listed in Supplementary Data 1); (2) co-occupancy of subunits of the cohesin complex and the transcription factor Znf14331 from 38 published ChIP-seq datasets (Supplementary Data 1); (3) CTCF-binding conservation at orthologous regions in four different mammalian species32 (Supplementary Data 2); and (4) whether both flanking TADs contain genes with known roles in embryonic development, preferentially showing divergent patterns of tissue-specific expression (Fig. 1, Supplementary Fig. 1, Supplementary Data 1–3, “Methods”). TAD boundaries that encompassed protein-coding genes were excluded. Following genome-wide prioritization, we selected and deleted 8 individual TAD boundaries from the mouse genome through pronuclear injection of fertilized eggs using CRISPR/Cas9. For all deletions, the outer borders of the boundaries were defined by canonical criteria including the presence of CTCFs and cohesin complex proteins, which are the hallmark of TAD boundaries that are conserved across cell types in closely related species (refs. 13,15,16,17,18,19; see “Methods” for details). These deletions ranged in size from 11 to 80 kb and removed all known CTCF and cohesin binding sites in each TAD boundary region, while leaving any nearby protein-coding genes intact (Fig. 1, Supplementary Fig. 1, Supplementary Data 3, “Methods”). For all eight boundaries, live founder mice heterozygous for the targeted deletion were successfully obtained and bred into stable lines to assess molecular and organismal phenotypes./p>

6000 data points across 350 total measurements; Fig. 4a, Supplementary Fig. 10 and Supplementary Data 7). These systematic phenotyping efforts identified 30 additional parameters with individually significant deviations from wild-type controls (Supplementary Data 7). However, due to the limited sample size and the large number of parameters assessed, these initial observations are generally not significant after correction for multiple hypothesis testing. Nevertheless, in conjunction with the independently observed viability, chromatin, and expression phenotypes in these lines, these data provide leads for further in-depth characterization./p>

0.05; Fig. 3 and Supplementary Fig. 4. Interaction frequencies between genomic loci were additionally visualized on Juicebox (Supplementary Fig. 4)53,54./p>