HDAC1 e HDAC6 são essenciais para impulsionar o crescimento no glioma mutante IDH1

Scientific Reports volume 13, Artigo número: 12433 (2023) Citar este artigo

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Gliomas de baixo grau e secundários de alto grau freqüentemente contêm mutações nas enzimas metabólicas IDH1 ou IDH2 que supostamente impulsionam a tumorigênese, inibindo muitas das enzimas reguladoras da cromatina que regulam a estrutura do DNA. Os inibidores da histona desacetilase são agentes anticancerígenos promissores e já foram utilizados em ensaios clínicos. No entanto, falta uma compreensão clara do seu mecanismo ou alvos genéticos. Neste estudo, os autores dissecam geneticamente culturas mutantes IDH1 derivadas de pacientes para determinar quais enzimas HDAC impulsionam o crescimento em gliomas mutantes IDH1. Um painel de linhas celulares de gliomasfera derivadas de pacientes (2 linhas mutantes IDH1, 3 linhas IDH1 de tipo selvagem) foi submetido a um rastreio de drogas modificadoras epigenéticas de diferentes classes epigenéticas. O efeito do LBH (panobinostat) na expressão gênica e na estrutura da cromatina foi testado em linhagens mutantes IDH1 derivadas de pacientes. O papel de cada uma das enzimas HDAC altamente expressas foi dissecado molecularmente usando vetores knock-down de interferência de RNA lentiviral e um modelo in vitro de glioblastoma mutante IDH1 derivado do paciente (HK252). Estes resultados foram então confirmados num modelo de xenotransplante in vivo (BT-142). A mutação IDH1 leva à regulação negativa do gene, hipermetilação do DNA, aumento da acessibilidade do DNA e hipoacetilação do H3K27 em dois modelos distintos de superexpressão do mutante IDH1. A triagem de drogas identificou inibidores de histona desacetilase (HDACi) e panobinostat (LBH) mais especificamente como os compostos mais seletivos para inibir o crescimento em linhas de glioma mutantes IDH1. Das onze enzimas HDAC anotadas (HDAC1-11), apenas seis são expressas em amostras de tecido de glioma mutante IDH1 e linhas de gliomasfera derivadas de pacientes (HDAC1-4, HDAC6 e HDAC9). Experimentos de eliminação de lentivírus revelaram que HDAC1 e HDAC6 são os mais consistentemente essenciais para o crescimento tanto in vitro quanto in vivo e têm como alvo módulos genéticos muito diferentes. A derrubada de HDAC1 ou HDAC6 in vivo levou a um tumor mais circunscrito e menos invasivo. A desregulação genética induzida pela mutação IDH1 é generalizada e apenas parcialmente reversível pela inibição direta do IDH1. Este estudo identifica HDAC1 e HDAC6 como enzimas importantes e alvo de medicamentos que são necessárias para o crescimento e invasividade em gliomas mutantes IDH1.

Estudos de sequenciamento de gliomas adultos de baixo grau revelaram mutações pontuais nos sítios ativos das enzimas metabólicas IDH1 e IDH2 que conferem uma nova função enzimática de redução do alfa-cetoglutarato ao oncometabólito 2-hidroxiglutarato (2-HG)1. Muitas enzimas reguladoras da cromatina (por exemplo, TET DNA demetilases e JMJ histona desmetilases) requerem alfa-cetoglutarato como cofator e em altas concentrações o 2-HG pode atuar como um inibidor competitivo levando à hipermetilação de DNA e histonas com resultante gene generalizado down- regulamento2. Desde essa descoberta, a maioria das pesquisas concentrou-se no efeito das mutações IDH1 e IDH2 no TET2 e na hipermetilação do DNA, deixando as histonas relativamente pouco estudadas3,4,5. Mutações TET2 e IDH são comuns e mutuamente exclusivas na leucemia mielóide aguda6 (LMA) e camundongos knockout para Tet2 e IDH1 desenvolvem espontaneamente leucemia7,8. Isto sugere que, no caso da LMA, a mutação IDH1 funciona principalmente através da inibição da função TET2. No entanto, o mecanismo tumorigênico das mutações do IDH nos gliomas é menos claro. Mutações TET2 são raras no glioma e nem camundongos knockout para Tet2 nem IDH1 geram espontaneamente tumores cerebrais.

Estudos de sequenciamento de gliomas pontinos intrínsecos difusos de baixo grau (DIPG) pediátricos histologicamente semelhantes revelaram uma única substituição de lisina por metionina na subunidade de histona H3 (H3K27M)9,10,11. Em circunstâncias normais, a lisina H3K27 pode ser acetilada (H3K27ac) ou metilada (H3K27me3) com resultante abertura ou fechamento do nucleossomo, respectivamente . Modelos de camundongos mostram que a mutação H3K27M leva ao aumento da acetilação de histonas e ao aumento da expressão gênica9,10. Curiosamente, esses estudos também mostraram que os níveis de acetilação do H3K27 se correlacionam com as concentrações intracelulares de alfa-cetoglutarato, levando à hipótese de que as mutações IDH1/2, que causam depleção de alfa-cetoglutarato, podem levar a uma desacetilação correspondente do H3K27 .

2 fold changed) genes from each of the drug treatment data sets was assigned to one of the following sub-groups: (1) unique to one of the HDAC knockdown sets, (2) “non-unique” i.e. shared by more than one HDAC knock-down gene set, or (3) “unaccounted” if the gene was not found in any of the HDAC knock-down sets). (D) RNA-seq datasets from each knockdown as well as drug treatment samples (1 mM VPA, and 15 nM LBH) underwent PCA analysis (HK252)./p>

200 nucleotides) was purified from cells using the Quick-RNA MiniPrep Plus Kit (Zymo Research, #R1057). The quality control check on RNA-seq reads was performed with FastQC v0.11.7. Adapter sequences and bad quality segments were trimmed using Trim Galore! v0.4.2 and cutadapt v1.9.1. The trimmed reads were aligned to the reference human genome version GRCh38/hg38 with the program STAR v2.6.1e. Duplicate aligned reads were removed using the program sambamba v0.6.8. Gene-level expression was assessed by counting features for each gene, as defined in the NCBI's RefSeq database. Read counting was done with the program featureCounts v1.6.2 from the Rsubread package. Raw counts were normalized with respect to library size and transformed to log2 scale using rlog() function in R package DESeq2 v1.26.0./p>